分离！分离！定量先分离！

在液相色谱仪定量分析中，分离开是首要要求。基线分离是提供***结果的有效保障。

含有5个组分或更少的样品，使谱峰之间达到基线分离（R＞1.5)一般较为容易。分离度会随色谱柱的使用时间逐步降低，也会由于分离条件的微小波动而在不同时间有所变化，因此在建立简单混合物的分离方法时，使R≥2。这样的分离度将有利于改善测试精度和方法的普适性；含10团种或10种以上组分的样品，分离一般会很困难，目标分离度往往***降低至R＞1.0—1.5。

有些HPLC测定不必使全部被测组分达到基线分离，这种情况常见于所测样品中可能存在数种化合物但仅需检测其中的一种时。比如在普查水或土壤样品中的某污染物(如定性分析不同的除芳剂)时，仅需要分离出个别除莠剂，确定其特征保留时间进行峰鉴别即可。

尽管大多数HPLC设备能在更高的压力下工作，使用新 色谱柱的工作压力不应超过170bar（2500psi , 17MPa），压力上限在2000psi以下。

限制该压力基于两点原因：

第 一、随着色谱柱的使用，微粒杂质会逐步堵塞柱头，使柱压成倍升高；

第二、较低的压力（< 170bar）适于泵、进样阀、尤其是自动进样装置的稳定工作，密封垫的寿命更长，色谱柱堵塞的情况减少，系统的耐久性明显提高。因此，以小于泵的zui大允许压力的50%作为目标压力。

a、色谱柱，色谱柱使用时间长了，柱效会降低，会影响到分离度的，改善方法是更换新的色谱柱。如果已经是新的色谱柱了，分离度还不好，那可以采用更长一些的色谱柱，也会增加分离度。

b、流动相的调节，通过调节流动相中各组分的比例，使流动相的极性发生变化，分离效率会不一样，这要针对要检测的成分具体情况进行分析确定。

c、改变柱温，相同条件下升高柱温，会增***谱柱的分离能力而提高分离度。

a、样品性质

主要了解化合物的结构、分子量、pKa、UV、样品浓度范围、溶解度等。

b、色谱柱选择

样品能溶于水-有机混合液的大多数样品（特别是中性或非离子化合物），可以选择反相HPLC，流动相选择水-有机溶剂，色谱柱可以选择C18、C8、TMS、苯基、氰基。一般C18用得比较多。

样品为离子或可电离的化合物（特别是碱性或阳离子样品），可以选择离子对HPLC，流动相选择水-有机溶剂，控制pH的缓冲液和离子对试剂，色谱柱可选择C18、C8、氰基。一般C18用得比较多。

若反相或离子对HPLC无效时，或样品不溶于水-有机混合液。可以选择正相HPLC体系。流动相选择有机溶剂混合液，色谱柱选择氰基、氨基、硅胶、二醇基。

c、初始分离条件（相对较好的首要选择、等度）

色谱柱：150X4.6mm、5um、固定相为C18或C8

流动相：缓冲液-乙腈，缓冲液可选择纯水或缓冲盐（浓度10~30mM）（若中性样品，无需使用缓冲盐）并用酸碱调控pH（如果pH小于2.5，建议选择pH稳定的色谱柱，避免固定相流失），乙腈起始比例可以选择80~ 1 00%。

离子对等添加剂，开始时请不要使用。流速1.0~2.0ml/min，柱温35~40℃。

样品：（以流动相溶解样品）进样体积小于25uL，进样量小于***ug。

d、液相方法基本目标

分离度：R大于1.5

分离时间：5~10min较理想

定量：RSD小于2%

压力：基本要求小于200bar（20M）

针对基本目标，按实际情况进行调整，譬如流动相实际组分比例，缓冲盐浓度及pH，柱温，梯度等。

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